Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomal MicroRNA-126-3p Inhibits Pancreatic Cancer Development by Targeting ADAM9

骨髓间充质干细胞衍生的外泌体MicroRNA-126-3p通过靶向ADAM9抑制胰腺癌的发展

期刊：Molecular Therapy-Nucleic Acids

影响因子：8.88

胰腺癌是一种致命的恶性肿瘤，有效的治疗方法相对较少，是癌症的第四大死因，其生存率非常。尽管胰腺癌的治疗方法有所改进，但在过去几十年里，胰腺癌的死亡率几乎没有变化，这主要是由于缺乏足够的筛查方法和早期诊断的生物标志物。

骨髓间充质干细胞（BMSC）可以被定义为一种类似于成纤维细胞的非造血细胞家族，最初被用作多能祖细胞。骨髓间充质干细胞已经被证明能够迁移到肿瘤组织中，有研究推测它们在胰腺癌基因治疗中具有一定的潜力。

外泌体是一种小的、膜包裹的囊泡(30-150纳米)，可将蛋白质、脂质和核酸等物质从原始细胞运送到受体细胞。研究表明从骨髓间充质干细胞(BMSC)来源的外泌体释放的小泡可以将功能性RNA转移到受体细胞。特别是有报道称外泌体可以携带microRNAs (miRNAs)，参与癌细胞增殖、分化和凋亡。

miR-126-3p，一种miRNA亚型，已被证明是一种肿瘤抑制因子，而报告表明，它可能能够抑制癌症的进展。miR -126-3p在食管鳞状细胞癌(ESCC)中表达下调，与患者的不良预后相关。此外，有报道称miR-126-3p能够抑制胰腺癌患者血浆中的细胞转移、侵袭和调节失调。有报道称miR-126-3p负调控一种分解整合素和一种金属蛋白酶-9 (ADAM9)。

探讨经BMSC来源的外泌体转移的miR-126-3p在胰腺癌中的作用。

1、miR-126-3P在胰腺癌中靶向ADAM9

通过分析4组胰腺癌表达芯片数据，比较每个芯片前400个差异基因并绘制venn图，得到ADAM9是4组中的共同的差异基因。

分别绘制GEO: GSE101448和GSE32676芯片前60个差异表达基因的热图谱表达情况。

与正常组织相比，从GEO: GSE16515和GSE71989芯片中，ADAM9在胰腺癌组织中高表达。

利用表达谱交互分析(Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)数据库，测定和检索ADAM9在胰腺癌组织和正常组织中的表达，分析表达与生产条件的相关性。证明ADAM9在胰腺癌组织中的表达高于正常组织。

生存分析显示，ADAM9表达越高，胰腺癌患者的总生存率越低。

通过分析TargetScan, miRSearch, miRTarBase, miRWalk, 和 mirDIP数据库，预测调控ADAM9的miRNA，得到三个候选miRNAs, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-126-3p, and hsa-miR-373-3p。

通过R筛选胰腺癌miRNA表达芯片GEO: GSE28955，在上述三个靶向ADAM9的miRNA中，只有hsa-miR-126-3p在胰腺癌组织中表达较低，提示miR-126在胰腺癌中可以靶向ADAM9。

2、miR-126-3P在胰腺癌中表达较低

通过qPCR检测到miR-126-3p在胰腺癌组织中的表达显著降低。

在胰腺癌细胞中PANC-1/SW1990/Canpan-1/AsPC-1/PC-3/MIAPaCa-2的表达显著低于正常胰腺癌细胞HPC-Y5。

miR-126-3p在胰腺癌细胞PANC-1中的表达最低。

3、miR-126-3P抑制胰腺癌细胞侵袭、转移，促进凋亡

miR-126-3p mimic组细胞的增殖能力、侵袭能力降低，凋亡能力增加；

相反， miR-126-3p inhibitor组细胞的增殖、侵袭能力增加，凋亡能力降低。

4、miR-126-3P靶向调控ADAM9表达

通过分析miR-126-3p 在ADAM9的3·UTR上有结合位点，报告基因实验证实miR-126-3p调控ADAM9，通过WB和qPCR验证miR-126-3p对ADAM9的调控作用。

5、miR-126-3P通过负向调控ADAM9抑制胰腺癌细胞侵袭、转移，促进凋亡

在胰腺癌细胞中，通过si干扰ADAM9的表达，可以降低细胞的增殖能力、侵袭能力和促进细胞凋亡；

与抑制miR-126-3p组相比，同时抑制miR-126-3p和干扰ADAM9可以抑制细胞的增殖、侵袭和促进凋亡。

6、分选BMSC及鉴定

通常认为CD29、CD44和CD71被认为是BMSC表达的标志，CD34和CD45被认为是造血干细胞标志物。

通过流式分析CD29(97.60%)、CD44(98.90%)、CD71(99%)阳性，HLA-DR(6.11%)、CD34(3.12%)， CD45(2.41%)均为阴性，提示培养的细胞为BMSCs。

油红O染色验证了脂质成分的沉积，凸显了BMSC的脂质分化能力。

诱导培养3 天后，细胞呈短梭形，体积增大。培养第7天，细胞呈多角形，胞浆内可见钙颗粒。培养第14天，整个细胞充满钙颗粒，细胞呈菌落状生长。中心的细胞除了失去其典型的细胞结构外，还逐渐融合，形成透明的钙结节。

7、BMSC来源的外泌体携带miR-126-3p

通过超速离心方法分离BMSC来源的外泌体。

外泌体鉴定：电镜、NanoSightNS300、WB测CD63、HSP70

外泌体与PANC-1细胞共培养，miR-126-3p在BMSC、外泌体和PANC-1中升高，ADAM9降低。

8、GW4869抑制BMSC来源的外泌体释放，抑制miR-126-3p的表达

使用GW4869抑制外泌体的释放，可以抑制miR-126-3p的表达，促进细胞的侵袭。

9、BMSC来源的外泌体转移miR-126-3p到胰腺癌细胞，影响细胞生物学功能

与BMSCs-miR-126-3p NC 组相比， BMSCs-miR-126-3p mimic组细胞的移行、侵袭和增殖能力显著降低，凋亡能力增加。

WB检测结果显示MMP-14、COX-2、Ki67、VEGF的表达均降低。

10、过表达miR-126-3p抑制癌细胞增殖

通过皮下移植瘤实验证实miR-126-3p抑制移植瘤的增殖，肿瘤体积及重量均显著低于对照组；ADAM9表达；

肿瘤组织种ADAM9、MMP-14、COX-2的蛋白水平降低。

BMSC来源的外泌体转移的miR-126-3p到胰腺癌细胞中，抑制ADAM9表达，抑制Ki67、COX-2、MMP-14的表达，抑制胰腺癌的侵袭、转移和增殖，促进其凋亡。

优点：

1.文章现有数据库入手，通过生信分析手段得到miR-126-3p与ADAM9可能是潜在的调控胰腺癌恶性表型的分子。 

2.文章不仅仅通过简单的改变胰腺癌细胞miR-126-3p的水平，更是通过BMSC外泌体转递miR-126-3p到胰腺癌细胞的方式检测miR-126-3p对胰腺癌细胞的生物学影响，为胰腺癌治疗提供新的思路。

不足：

文章证实miR-126-3p可以调控ADAM9的表达，影响胰腺癌的生物学功能，但是并未详细的证实ADAM9是如何影响胰腺癌细胞恶性表型。

外泌体作为miRNA的载体，用于疾病治疗研究模式。