Exosomes From miR-19b-3p-Modified ADSCs Inhibit Ferroptosis in Intracerebral Hemorrhage Mice

来自miR-19b-3p修饰的ADSC的外泌体抑制脑出血小鼠的铁凋亡

期刊名：Front Cell Dev Biol ；

发表日期：2021年07月

2021年影响因子：6.68

1、脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指非创伤性脑内血管破裂，导致血液在脑实质内聚集的一类临床综合征，属于脑卒中的一种类型，具有较高的致残率和死亡率。目前对脑出血后神经元细胞的死亡机制尚不十分清楚。

2、铁死亡是指在铁离子的参与下,因铁依赖性活性氧的异常堆积而导致氧化还原平衡失调而引起的一种新型细胞死亡方式，不同于细胞凋亡、坏死和自噬。有研究报道，抑制铁死亡可以对神经退行性疾病具有一定的治疗效果。

3、外泌体是细胞外膜质纳米囊泡，将蛋白质、核酸(DNA和RNA)转运到靶细胞中，介导局部和系统的细胞间通信，从而改变受体细胞的行为。脂肪间充质干细胞（ADMSCs）目前被认为是细胞治疗和再生医学领域中一种功能丰富的工具,可产生和分泌多种外泌体,继承细胞的多种功能。

4、miR-19b-3p在ICH中的功能还未见报道，前期生信分析铁调节蛋白IRP2是miR-19b-3p的靶向结合基因，所以，推测miR-19b-3p可能调节IRP2参与调节ICH的发展。

方法：胶原酶用于诱导ICH的小鼠模型，血红素用于诱导培养神经元中的铁凋亡。从模拟NC-或miR-19b-3p模拟转染ADSC（分别为ADSC-MNC-Exos或ADSC-19bM-Exos）中分离出外泌体，然后施用于ICH小鼠或血红素处理的神经元。通过评估ICH小鼠的神经功能和神经元的细胞活力来评估ICH损伤。在小鼠大脑或培养的神经元中评估铁凋亡。通过荧光素酶报告测定法分析了miR-19b-3p与铁调节蛋白2（IRP2）3′-UTR之间的相互作用。

1. 脑损伤小鼠中miR-19b-3p的表达下降，并发生了铁死亡

（A）假手术小鼠和ICH模型小鼠在ICH通过qRT-PCR检查后6，12，24和48小时的miR-19b-3p的血浆水平。

（B）通过mNSS评估小鼠ICH后48 h的神经功能。

（C）48小时时大脑中的铁沉积是通过Perls的普鲁士蓝色染色（比例尺：10μm）确定的。

（D）IRP2 mRNA水平的qRT-PCR分析和

（E）小鼠ICH后48小时在大脑中IRP2，FPN和TfR1的蛋白质印迹分析。

（F）ICH后48 h小鼠大脑中铁，MDA，GSH和GPX4的含量。

2. 沉默IRP2减弱血红素诱导的原代神经元细胞铁死亡

（A）检查MTT测定的细胞活力，（B）IRP2，TfR1和FPN的蛋白质印迹分析，以及（C）用血红素（100μM）或盐水处理24小时的初级皮质神经元中的铁，MDA，GSH和GPX4水平。 和（G）原发皮质神经元中的铁，MDA，GSH和GPX4水平，这些神经元被转染为sh-IRP2或sh-NC并用血红素（100μM）处理24小时。

3. 来源于miR-19b-3p过表达ADSCs的外泌体抑制血红素诱导的原代神经元细胞铁死亡

当原代神经元在血红素刺激下与ADSC-19bM-Exos一起孵育时，细胞活力明显获救（右图B），IRP2 mRNA和蛋白质水平以及TfR1蛋白水平显着降低（右图C，D），而FPN蛋白水平显着增加（右图D）。

此外，ADSCs-19bM-Exos导致铁和MDA水平显着降低，GSH和GPX4水平以及GPX4蛋白表达明显增加（右图E和补充图1D），这意味着来自ADSC的外泌体miR-19b-3p废除了血红素诱导的铁凋亡。

4. 来源于miR-19b-3p过表达ADSCs的外泌体抑制脑损伤小鼠的铁死亡  

（A）小鼠ICH后48小时血浆中miR-19b-3p水平的qRT-PCR分析。

（B）通过mNSS评估小鼠ICH后48 h的神经功能。

（C）在小鼠ICH后48小时对大脑中IRP2，FPN和TfR1进行蛋白质印迹分析。

（D）小鼠大脑中48小时的铁沉积是通过Perls的普鲁士蓝色染色（比例尺：10μm）确定的。

（E）ICH后48 h小鼠脑中铁，MDA，GSH和GPX4的含量。

结果表明，IRP2沉默降低了造血素处理的原代神经元中的TfR1并增加了FPN。可以买球赛的软件在这里的研究结果提出了一个模型，其中铁吸收增加（高TfR1）和铁出口减少（低FPN）有助于支持ICH中高水平的不稳定铁。文献研究结果进一步表明，IRP2的敲低会影响ICH中的铁凋亡。

文献研究结果提供了进一步的证据，证明IRP2沉默减弱了血红素诱导的细胞毒性和铁凋亡。

研究结果首次表明，源自miR-19b-3p过表达ADSC的外泌体减弱了ICH诱导的铁凋亡，其潜在机制可能与其靶向铁调节蛋白IRP2有关。具体而言，在ICH小鼠中观察到miR-19b-3p表达降低和IRP2表达增加。IRP2被证实是使用荧光素酶报告测定法的miR-19b-3p的直接靶标。可以买球赛的软件还发现，含有大量miR-19b-3p的ADSC-外泌体在mRNA和蛋白质水平上都降低了IRP2的表达。

总之，本研究表明，源自miR-19b-3p过表达ADSC的外泌体可减弱ICH诱导的铁凋亡和神经系统损伤。外泌体疗法与miR-19b-3p联合使用可能代表了ICH治疗的一种有希望的策略。